微生物檢測(cè)實(shí)用寶典

接種與分離方法

根據(jù)待檢樣品的性質(zhì)、培養(yǎng)目的和所用培養(yǎng)基的種類，采用不同的接種方法。

1.平板劃線分離培養(yǎng)法

對(duì)混有多種細(xì)菌的樣品，采用劃線分離和培養(yǎng)，使原來混雜在一起的細(xì)菌沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個(gè)菌落，以獲得純種。劃線的形式有多種，可將一個(gè)平板分成四個(gè)不同面積的小區(qū)進(jìn)行劃線，*區(qū)（A區(qū)）面積zui小，作為待分離菌的菌源區(qū)，第二和第三區(qū)（B、C區(qū)）是逐級(jí)稀釋的過渡區(qū)，第四區(qū)（D區(qū)）則是關(guān)鍵區(qū)，使該區(qū)出現(xiàn)大量的單菌落以供挑選純種用。為了得到較多的典型單菌落，平板上四區(qū)面積的分配應(yīng)是D＞C＞B＞A。

2.瓊脂斜面接種法

主要用于菌落的移種，以獲得純種進(jìn)行鑒定和保存菌種等。用接種環(huán)（針）挑取單個(gè)菌落或培養(yǎng)物，從培養(yǎng)基斜面底部向上劃一條直線，然后再?gòu)牡撞垦刂本€向上曲折連續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止。

3.穿刺接種法

此法多用于半固體培養(yǎng)基或三糖鐵、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種，半固體培養(yǎng)基的穿刺接種可用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。接種時(shí)用接種針挑取菌落，由培養(yǎng)基中央垂直刺仄至距管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。三糖鐵等有高層及斜面之分的培養(yǎng)基，穿刺搞層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。

4.液體培養(yǎng)基接種法

用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，傾斜液體培養(yǎng)管，在液面與管壁交界處研磨接種物，使細(xì)菌均勻得散落在液體培養(yǎng)基中。此接種法應(yīng)避免接種環(huán)與液體過多接觸。

5.傾注平板法

本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等樣品中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。取純培養(yǎng)物的稀釋液或原樣品lml至無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再將已融化并冷卻至45-50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15-20ml傾注入該無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，混勻，待凝固后置37℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以求出每毫升樣品中所含菌數(shù)。

6.涂布接種法

涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計(jì)算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長(zhǎng)形成菌苔的特點(diǎn)用于檢測(cè)化學(xué)因素對(duì)微生物的抑殺效應(yīng)。將一定量的菌液或稀釋液加到瓊脂培養(yǎng)基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養(yǎng)，本法經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)菌形成菌苔。

高壓滅菌鍋滅菌效果的監(jiān)測(cè)方法

高壓鍋的滅菌效果關(guān)系到zui終試驗(yàn)結(jié)果的成敗，因此，實(shí)驗(yàn)室要定期對(duì)高壓鍋的滅菌效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)，目前監(jiān)測(cè)的方法主要有以下3種：

1、化學(xué)指示卡

化學(xué)指示卡只能監(jiān)測(cè)滅菌鍋的滅菌溫度，并不能監(jiān)測(cè)滅菌時(shí)間，通過顏色變化來達(dá)到監(jiān)測(cè)效果。

優(yōu)點(diǎn)是使用方便快捷，缺點(diǎn)是不能監(jiān)測(cè)滅菌時(shí)間。

 如果高壓鍋使用的頻率較高，建議每次都在需要滅菌的的材料外側(cè)使用化學(xué)指示卡作為標(biāo)識(shí)。

2、留點(diǎn)溫度計(jì)

留點(diǎn)溫度計(jì)標(biāo)化合格后方可用于驗(yàn)證試驗(yàn)。檢測(cè)前，需將溫度計(jì)的水銀柱甩至40℃以下。每次監(jiān)測(cè)后留點(diǎn)溫度計(jì)的溫差應(yīng)在1℃之間，則說明滅菌器內(nèi)的溫度分布是均勻的。

  如果高壓鍋使用的頻率較高，建議每個(gè)月用留點(diǎn)溫度計(jì)對(duì)高壓鍋滅菌效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

3、生物指示劑

生物指示劑是一類特殊的活微生物制品，可用于確認(rèn)滅菌設(shè)備的性能，滅菌程序的驗(yàn)證，生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控等。

 1）按結(jié)構(gòu)分可分為片狀生物指示劑和自含式生物指示劑。一般來說都是用的自含式的多，就是里面有菌片，外面是密封的安瓿。

2）按培養(yǎng)時(shí)間可分為通用型生物指示劑和快速型生物指示劑。通用型生物指示劑根據(jù)芽孢復(fù)蘇后指示菌種新陳代謝引起培養(yǎng)液pH改變，通過酸堿指示劑變色來進(jìn)行判讀，時(shí)間一般在24或48小時(shí)以上；而快速型生物指示劑根據(jù)芽孢復(fù)蘇后的酶促反應(yīng)，通過熒光進(jìn)行判讀，時(shí)間一般為3-4小時(shí)，同時(shí)正在研發(fā)更加快速的生物指示劑，有望在1小時(shí)之內(nèi)得出結(jié)果。

生物指示劑也是GB15981-1995《消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)》中使用的壓力蒸汽滅菌效果的監(jiān)測(cè)方法。

 優(yōu)點(diǎn)是能夠監(jiān)測(cè)滅菌溫度和時(shí)間，缺點(diǎn)是所需時(shí)間較長(zhǎng)。

建議每個(gè)季度用生物指示劑進(jìn)行高壓鍋滅菌效果的監(jiān)測(cè)。

定量檢測(cè)方法（平板法）注意事項(xiàng)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)可分為定量檢驗(yàn)和定性檢驗(yàn)兩類，其中定量檢驗(yàn)又以平板法和MPN法兩種zui為常見。下面以平板法為例，簡(jiǎn)單介紹下定量檢測(cè)中一些常見注意事項(xiàng)，以供大家在日常工作中參考。

1、均質(zhì)效果對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。均質(zhì)過程是將樣品與稀釋液混勻的過程，如果均質(zhì)效果不好就會(huì)使樣品中的微生物不能充分混勻到稀釋液中，那么試驗(yàn)結(jié)果就不能體現(xiàn)樣品的真實(shí)情況。一般試驗(yàn)數(shù)值都小于真實(shí)值，目前的均質(zhì)方式是旋轉(zhuǎn)刀均質(zhì)器的均質(zhì)杯法和拍擊式均質(zhì)器的均質(zhì)袋法。大家可以根據(jù)自己樣品的實(shí)際情況進(jìn)行選擇。

2、十倍梯度稀釋對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。十倍梯度稀釋對(duì)定量檢測(cè)方法的影響是很大的，因?yàn)樗梢詫⒃囼?yàn)誤差成倍的放大。比如10-1到10-2稀釋時(shí)，如果只取了0.98mL，那么到10-5時(shí)，誤差就被放大了1000倍。所以在這步操作時(shí)一定注意取液量要，并且每次稀釋后，要將稀釋液混合均勻，再進(jìn)行下一步稀釋。

3、平板接種的注意事項(xiàng)。無論是涂布還是傾注接種，都要讓微生物分布均勻，且盡量靠近中間，遠(yuǎn)離邊緣，因?yàn)榫渖L(zhǎng)在邊緣時(shí)，不容易讀取，且易連成片，在涂布時(shí)，要在平板中間加入稀釋液開始涂布，盡量不要將液體涂布到邊緣。在傾注時(shí)，也要將稀釋液加到平板中間，然后傾注培養(yǎng)基，并輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使之混合均勻。

大腸菌群MPN法的常見問題

①試驗(yàn)所依據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)

先，查看要求MPN值的單位，是MPN／g還是MPN／100g。如果是MPN／g，按照

GB4789.3-2016進(jìn)行試驗(yàn)；如果是MPN／100g，依據(jù)衛(wèi)生部頒布的通知要求，可以按照GB4789.3―2003進(jìn)行試驗(yàn)。

②雙料的接種和MPN表的檢索方法

如果制備的稀釋度為10-1、10-2、10-3。其中，10-1取10mL接種于3管雙料初發(fā)酵培養(yǎng)基中，另取10-1 1mL接種于3管單料初發(fā)酵培養(yǎng)基中，10-2取1 mL接種于3管單料初發(fā)酵培養(yǎng)基中。完成MPN法的初發(fā)酵接種。

zui后判定結(jié)果時(shí)，要依據(jù)復(fù)發(fā)酵的結(jié)果來推出初發(fā)酵為陽性的管數(shù)，再結(jié)合初發(fā)酵接種的稀釋度為1，0.1，0.01。檢索MPN表進(jìn)行判定，注意表內(nèi)MPN值隨稀釋度的變化有相應(yīng)的變化。

③如何判定產(chǎn)氣

在MPN法中，初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵陽性管的主要判定依據(jù)是產(chǎn)氣，但做樣品檢測(cè)時(shí)，很多時(shí)候大腸菌群的產(chǎn)氣量不多，在小導(dǎo)管中很難看到，這時(shí)不能直接判定為陰性。輕輕晃動(dòng)試管，然后將試管傾斜一定角度，如果有大量小氣泡從底部升上來，并有逐漸增多的趨勢(shì)，可判定為陽性。

生化試驗(yàn)可疑菌純化的目的

致病菌檢測(cè)過程中，生化試驗(yàn)或者初步篩選以后確證性試驗(yàn)以前，一般要求將可疑菌菌落純化于特定營(yíng)養(yǎng)型平板上，比如單增李斯特檢驗(yàn)使用TSA-YE進(jìn)行可疑菌純化，沙門氏菌和志賀氏菌檢測(cè)使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行純化?？梢删兓哪康挠腥缦聨c(diǎn)：

一、根據(jù)純化以后的平板上生長(zhǎng)的菌落大小及形態(tài)，可以判斷挑取的可疑菌是不是單獨(dú)的純菌落，有沒有發(fā)生菌落疊加現(xiàn)象。

二、生化試驗(yàn)一般項(xiàng)目較多，選擇性分離平板上的可疑菌一般都帶有顏色，無法制作菌懸液。生長(zhǎng)較小的可疑單菌落無法滿足接菌量要求，而且不能保證每個(gè)項(xiàng)目接菌量相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有差異。而純化以后的平板上的所有菌落均來源于同一個(gè)單菌落，有大量的菌供生化試驗(yàn)使用。

三、選擇性分離平板一般都成分復(fù)雜，并且有一定抑制性，其中可能含有某些對(duì)個(gè)別生化產(chǎn)生影響的物質(zhì)。而用于純化的平板都是營(yíng)養(yǎng)型的，不會(huì)對(duì)生化項(xiàng)目造成影響。

沙門氏菌檢驗(yàn)中血清學(xué)試驗(yàn)常見問題

血清學(xué)鑒定是沙門氏菌檢驗(yàn)中的重要鑒定方法，包括菌體抗原（0）鑒定、鞭毛抗原（H）鑒定和Vi抗原鑒定。由于血清學(xué)試驗(yàn)涉及的內(nèi)容很多，所以我們?cè)诖私o大家列出幾個(gè)常見問題，以供大家在日常工作中參考。

1、沙門氏菌判定時(shí)以生化試驗(yàn)結(jié)果為主還是血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果為主？

我們?cè)谂卸〞r(shí)應(yīng)該以生化試驗(yàn)結(jié)果為主，在生化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行血清學(xué)判定。有的試驗(yàn)人員會(huì)直接用多價(jià)血清進(jìn)行試驗(yàn)，不進(jìn)行生化試驗(yàn)，這是不可取的。因?yàn)檠鍖W(xué)的原理是抗原抗體結(jié)合，非沙門氏菌的微生物也有可能帶有沙門的類似抗原的。所以我們做鑒定的時(shí)候，必須行生化試驗(yàn)，在生化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

2、血清學(xué)試驗(yàn)要做到什么程度？

如果我們只需要鑒定某個(gè)菌株是否屬于沙門氏菌，那只需要做0多價(jià)和H多價(jià)血清就可以了。如果需要鑒定某個(gè)菌株具體是什么沙門氏菌，比如是否為鼠傷寒沙門氏菌或是否為腸炎沙門氏菌，那就需要進(jìn)行血清學(xué)分型試驗(yàn)，從多價(jià)血清一直做到0抗原和H抗原的單因子，然后參照GB4789.4-2016沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中附錄B的表格查找對(duì)應(yīng)的沙門菌名。

3、0多價(jià)血清不凝集，就一定是0抗原陰性么？

我們?cè)谧?多價(jià)血清時(shí)，如果沒有凝集并不能直接判定為陰性，因?yàn)槲覀冞€要考慮Vi抗原的影響。Vi抗原屬于K抗原群，是會(huì)阻隔0抗原和相應(yīng)抗體的結(jié)合，所以有Vi抗原存在時(shí)，0多價(jià)血清是不會(huì)凝集的。GB4789.4-2016沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中提到已知具有Vi抗原的菌型有：傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和都柏林沙門氏菌。因此，我們必須去除Vi抗原的影響。具體方法是將待檢菌做成濃菌液，放入100℃沸水中煮沸15-60分鐘，目的是破壞Vi抗原，然后再挑取菌液做0多價(jià)血清。如果還是不凝集，才能判定為陰性。

熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察

日常試驗(yàn)中，經(jīng)常會(huì)遇到大腸桿菌需要觀察熒光是情況。GB 4789.38-2012大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)中第二法（VRBA-MUG計(jì)數(shù)），GB/T 5750.12-2006 水及水源水中的大腸埃希氏檢驗(yàn)，都需要觀察熒光，可見熒光結(jié)果觀察的重要性。

MUG是4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷的縮寫，該物質(zhì)為β-半乳糖苷酶作用的底物，β-半乳糖苷酶與MUG結(jié)合并剪切β-半乳糖苷鍵，釋放熒光顯色基團(tuán)4-甲基傘形酮，在紫外光（入＝366nm）下觀察，培養(yǎng)物發(fā)出藍(lán)色熒光。

觀察熒光的條件：

1）紫外光為366nm波長(zhǎng)；

2）在黑暗的環(huán)境下觀察，有助于更好的觀察熒光；

3）紫外燈燈管直接照射在待測(cè)平板或試管上，無玻璃等物品吸收紫外光。

4）使用空白管、陽性菌、陰性菌做對(duì)照。

使用“簡(jiǎn)易便攜式熒光檢測(cè)燈”，不但具備以上三個(gè)要求，而且避免了紫外燈直接照射人的情況，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有所保護(hù)。

空白產(chǎn)熒光原因分析：

1）試管或平血洗涮不干凈所致。試管或平血中殘留4-甲基傘形酮，會(huì)導(dǎo)致空白有熒光。

2）觀察熒光的紫外燈不合適。紫外燈波長(zhǎng)雖為366nm，但外側(cè)有玻璃燈罩、或者功率太大（瓦數(shù)太高、燈過亮）均會(huì)影響熒光效果。

3）試管或平血本身原因。有些試管或平血，本身由于質(zhì)量原因，在紫外燈下自身就帶有光亮。使用前，可以先拿幾種試管或平血裝入蒸餾水，先在紫外燈下觀察一下，然后挑取亮度比較暗的容器使用。

建議：

建議做熒光試驗(yàn)時(shí)，采用陽性對(duì)照菌同時(shí)觀察，可更簡(jiǎn)單明了。